Oligosacharydy w mleku kobiecym

K Karmienie naturalne, szczególnie wyłączne karmienie piersią przez 6 miesięcy lub dłużej, jest najwłaściwszym, zalecanym sposobem żywienia. Aktualne wytyczne WHO i ESPGHAN dotyczące opieki żywieniowej noworodków i niemowląt wskazują jednoznacznie, że mleko kobiece jest nie tylko najlepszym składnikiem odżywczym dla dziecka w ciągu pierwszych 6 miesięcy życia, ale jest również stosowane jako lek na oddziałach intensywnej terapii i patologii noworodków i stanowi nieodłączny element opieki postnatalnej, zwłaszcza dla noworodków urodzonych z małą masą ciała oraz dla noworodków urodzonych przedwcześnie. W porównaniu z karmieniem mieszanką, karmienie naturalne zmniejsza częstość występowania i/lub nasilenia chorób zakaźnych [1]. Wiele schorzeń, w tym biegunka, infekcje dróg oddechowych i układu moczowego, zapalenie ucha środkowego, bakteriemia i martwicze zapalenie jelit występują rzadziej u dzieci karmionych wyłącznie piersią [1, 2]. Ten sposób żywienia ma również wpływ na przebieg innych chorób związanych z układem odpornościowym i tolerancją immunologiczną takich jak celiakia, astma, alergia, cukrzyca typu 1, a także ostra białaczka limfoblastyczna i ostra białaczka szpikowa, oddziałuje także na zmniejszenie częstości występowania tych chorób [1, 3]. Korzyści te mogą częściowo wynikać z wpływu mleka swoistego gatunkowo na mikrobiotę jelitową [3, 4], która stymuluje dojrzewanie i specyficzność błony śluzowej noworodka oraz układu odpornościowego [5]. 
Rekomendacja mleka kobiecego, jako najlepszego sposobu żywienia noworodków i niemowląt, jest związana z jego unikatowym składem. Pokarm matki, oprócz podstawowych składników odżywczych: białek, tłuszczów, cukrów, zawiera także składniki bioaktywne, takie jak czynniki wzrostu, cytokiny, enzymy, hormony, glikoproteiny, glikolipidy, oligosacharydy oraz witaminy. Korzyści wynikające z karmienia piersią dla układu odpornościowego zostały przypisane różnorodnym bioaktywnym składnikom mleka ludzkiego [5, 6, 7]. Ponadto w mleku kobiecym znajdują się cząsteczki o właściwościach immunomodulujących, które wywierają istotny wpływ na dojrzewanie układu odpornościowego, pokarmowego i nerwowego oraz zapewniają ochronę przed patogenami, stanowiąc niezbędny element odporności przekazywanej noworodkowi wraz z mlekiem matki.
Do najważniejszych odpornościowych „cukrowych” składników mleka kobiecego zaliczamy glikoproteiny uczestniczące w odporności swoistej (S-IgA, IgM i IgG) oraz nieswoistej (laktoferyna), glikolipidy oraz wolne oligosacharydy mleka (HMO, ang. human milk oligosaccharides). Oligosacharydy obecne w mleku kobiecym stanowią trzecią co do wielkości frakcję mleka. Oligosacharydy mleka to cukry, które są obecne w mleku w postaci wolnej, tj. nie są przyłączone do cząsteczek białek i lipidów.
Wszystkie HMO zbudowane są na bazie cząsteczki laktozy (disacharydu zbudowanego z cząsteczki galaktozy połączonej wiązaniem β1,4-glikozydowym z cząsteczką glukozy), do której przyłączane są, za pomocą odpowiednich enzymów, inne cząsteczki monosacharydów, takich jak N-acetyloglukozamin (GlcNAc), fukoza (Fuc) i kwas sjalowy (SA). Synteza HMO odbywa się w aparacie Golgiego komórek pęcherzykowych gruczołu sutkowego. HMO reprezentują również niewiarygodną różnorodność strukturalną [8, 9, 10, 11]. W skład HMO wchodzi tylko 5 różnych jednostek monosacharydowych, niemniej jednak poszczególne monosacharady mogą być połączone ze sobą za pomocą różnych typów wiązań, co skutkuje powstawaniem zróżnicowanych struktur przestrzennych. Do tej pory zidentyfikowano ponad 200 różnych struktur wolnych oligosacharydów mleka zbudowanych z 3 do 22 monosacharydów [12, 13, 14]. 
Kluczowe w procesach rozpoznania biologicznego cząsteczki fukozy i kwasu sjalowego, wchodzące w skład poszczególnych HMO, są przyłączane za pomocą wiązań glikozydowych, fukoza może być przyłączona wiązaniem α1,2- i/lub α1,3/4 – odpowiednio do galaktozy (Gal) i GlcNAc, natomiast kwas sjalowy jest przyłączany za pomocą innych wiązań, tj. α2,3 i/lub α2,6 do tych samych cząsteczek monosacharydów. Obecne w strukturach oligosacharydów fukoza i kwas sjalowy, w przeciwieństwie do pozostałych monosacharydów budujących HMO, nie mogą być już podstawione innym monosacharydem [15, 16, 17].
Najprostsze oligosacharydy obecne w mleku kobiecym to trisacharydy, zbudowane z laktozy do której zostały przyłączone cząsteczki fukozy lub kwasu sjalowego za pomocą różnych wiązań glikozydowych. W ten sposób powstają cztery różne oligosacharydy, dwa po przyłączeniu fukozy do laktozy, tj. fukoza przyłączona wiązaniem α1,2-glikozydowym do galaktozy daje 2‘-fukozylolaktozę (2‘-FL), natomiast fukoza przyłączona wiązaniem α1,3-glikozydowym daje 3-fukozylolaktozę (3-FL), oraz dwa po przyłączeniu kwasu sjalowego do laktozy, tj. kwas sjalowy przyłączony wiązaniem α2,3-glikozydowym do galaktozy daje 3‘-sjalolaktozę (3‘-SL), natomiast kwas sjalowy przyłączony wiązaniem α2,6-glikozydowym do galaktozy daje 6‘-sjalolaktozę (6’-SL). Powstałe w ten sposób struktury wykazują znaczne różnice funkcjonalne [15, 18, 19].
Stężenie i wzajemne proporcje HMO ulegają zmianom w zależności od etapu dojrzewania mleka oraz tygodnia zakończenia ciąży. Ze względu na złożoność strukturalną HMO, a także brak standardów oraz stosowanie przez laboratoria różnych metod do oznaczania stężenia HMO, dostępne dane mogą się znacznie różnić. 
Stężenie HMO może się różnić w zależności od tygodnia porodu. Według Morrow i współpracowników [20] stężenie całkowitego HMO w mleku matek, które urodziły przedwcześnie, od 10. do 23. dnia laktacji było prawie dwukrotnie niższe niż w mleku matek, które urodziły w terminie, w tym samym okresie laktacji (odpowiednio 3,6 g/l i 6,1 g/l). Z innej strony, ostatnie badania przeprowadzone przez Kunza i współpracowników [9] wykazały, że całkowite stężenie HMO w mleku matek wcześniaków nie różniło się istotnie od mleka matek noworodków urodzonych o czasie. Brak zależności był widoczny niezależnie od etapu dojrzewania mleka i tak dla siary wartości kształtowały się na porównywalnym poziomie, dla porodu przedwczesnego 8,7 g/l i porodu w terminie 7,5 g/l, dla mleka przejściowego matek, które urodziły przedwcześnie 8,6 g/l i w terminie 9,1 g/l) oraz dla mleka dojrzałego, odpowiednio 8,6 g/l i 8,2 g/l.
W zależności od obecności cząsteczek fukozy i kwasu sjalowego w cząsteczce oligosacharydu, HMO dzielimy na: oligosacharydy obojętne, niezawierające cząsteczki kwasu sjalowego, oraz tzw. oligosacharydy kwaśne, które mogą zawierać jedną lub więcej cząsteczek kwasu sjalowego i są klasyfikowane jako sjalowane HMO. Ponadto oligosacharydy obojętne dzielimy na dwie podgrupy w zależności od obecności w ich strukturach cząsteczki fukozy, i tak wyróżniamy: niefukozylowane obojętne HMO oraz fukozylowane obojętne HMO. Dodatkowo niektóre HMO mogą zawierać zarówno cząsteczkę fukozy, jak i kwasu sjalowego i tworzyć kolejną podgrupę [16, 17]. Trzeba podkreślić, że dane dotyczące zawartości fukozylowanych, sjalowanych i niefukozylowanych obojętnych frakcji HMO nie są jednoznaczne. Według Ninonuevo i współpracowników [21] proporcje fukozylowanych i sjalowanych HMO w mleku ludzkim wynoszą odpowiednio 60–80% i 10–15% i nie różnią się znacząco na różnych etapach laktacji [21].Natomiast, jak ocenili
Donnovan i Comstock [7], zawartość poszczególnych frakcji HMO w mleku matek, które urodziły o czasie, jest inna, a mianowicie wynosi odpowiednio ~ 35–50% fukozylowanych, 12–14% sjalowanych, a 42–55% to niefukozylowane obojętne HMO. Ponadto, jak wykazali Kunz i współpracownicy [9], proporcje poszczególnych frakcji zależą od statusu wydzielniczego matki. W przeciwieństwie do fukozylowanych HMO, całkowity poziom sjalowanych HMO jest podobny i nie zależy od statusu wydzielniczego matek [9].
Matki mogą syntetyzować różne zestawy oligosacharydów. Najbardziej ekstremalne różnice międzyosobnicze dotyczą obecności lub braku fukozy w strukturach oligosacharydowych i są warunkowane przez czynniki genetyczne, które wpływają na tzw. status wydzielniczy oraz układ grupowy krwi Lewis (Lewis Blood Group) [8, 9].
W fukozylacji HMO kluczowe znaczenie odgrywają dwie fukozylotransferazy, a mianowicie FUT2 (kodowana przez tzw. gen wydzielniczy) i FUT3 (kodowana przez tzw. gen Lewis). Na tej podstawie wyróżnia się cztery różne grupy matek, u których profil fukozylowanych HMO jest odmienny:

• Wydzielacz (Se+/Le+) – stanowi ok. 70% populacji,
• Wydzielacz (Se+/Le-) – stanowi ok. 9% populacji,
• Niewydzielacz (Se-/Le+) – stanowi ok. 20% populacji, 
• Niewydzielacz (Se-/Le-) – stanowi ok. 1% populacji. 

Większość matek (79%) posiada aktywny gen dla fukozylotransferazy (FUT2), enzymu, który jest odpowiedzialny za przyłączanie fukozy wiązaniem α1,2 do końcowej Gal [22] w celu utworzenia struktur oligosacharydowych α2-fukozylowanych. W mleku matek ze statusem „wydzielacza” 2’–fukozylolaktoza (2’-FL) i lakto-N-fukopentoza I (LNFP-I) są jednymi z najbardziej rozpowszechnionych [10, 23, 24]. Matki, które nie mają funkcjonalnego enzymu FUT2 i posiadają status „niewydzielacza”, reprezentują około 21% kobiet, wytwarzają mleko pozbawione α1,2-fukozylowanych oligosacharydów, takich 2’-FL i LNFP I [8, 9]. Brak α2-fukozylowanych struktur oligosacharydowych może mieć konsekwencje funkcjonalne. Na przykład noworodki i niemowlęta karmione mlekiem kobiet, które nie są „wydzielaczami”, wykazują opóźnioną kolonizację bakteriami z rodzaju Bifidobacteriaceae, natomiast wyższą liczebność taksonów Streptococcus [25]. Niemowlęta karmione mlekiem matek „niewydzielaczy” są bardziej narażone na schorzenia przewodu pokarmowego [26]. 
Najnowsze badania Profesora Kunza [9] wykazały, że status „wydzielacza” ma także wpływ na całkowite stężenie HMO na kolejnych etapach dojrzewania mleka, a mianowicie wartość mediany dla całkowitego stężenie HMO w mleku matek „wydzielaczy” była znacząco wyższa niż w mleku matek „niewydzielaczy” i wynosiła dla siary odpowiednio 9,67g/l vs 5,17g/l, dla mleka przejściowego 9,47 g/l vs 5,61g/l i dla mleka dojrzałego 8,67g/l vs 5,54 g/l.
Interesujące jest również to, że stężenia poszczególnych HMO zmieniają się na kolejnych etapach laktacji, przy czym różne HMO wykazują różną dynamikę zmian [27]. Stężenia HMO, takich jak 6‘-SL lub LNT, zmniejszają się szybciej w pierwszych tygodniach laktacji, podczas gdy 2’-FL i 3’-SL zmniejszają się wolniej w dłuższym okresie czasu. Wykazano, że fukozylowane i sjalowane HMO są podobne w mleku kobiet, które urodziły przedwcześnie i w terminie, chociaż mleko kobiet rodzących przedwcześnie jest bardziej zróżnicowane pod względem ekspresji fukozylowanych HMO [28].
W przypadku HMO pytanie, co jest normą, nadal pozostaje bez odpowiedzi. Najnowsze badania wieloośrodkowe wykazały, że na profil HMO w mleku kobiecym oprócz czynników genetycznych mogą mieć wpływ czynniki środowiskowe. 
Stężenia poszczególnych frakcji, a nawet pojedynczych HMO, jak sugerują McGuire i współpracownicy [29], różnią się geograficznie. Badania wykazały, że m.in. stężenie sjalowanych HMO było ponad 2 razy wyższe w mleku matek w Ghanie (średnio 3,6 mmol/l) w porównaniu do stężenia w mleku matek w Szwecji (średnio 1,6 mmol/l), natomiast dla 6’-SL stężenie było ponad czterokrotnie wyższe w mleku matek w Ghanie niż w mleku matek w Szwecji [29]. Autorzy wskazali jednak, że aby potwierdzić tę hipotezę, konieczne są ukierunkowane analizy genomowe w celu ustalenia, czy różnice te wynikają przynajmniej częściowo ze zmienności genetycznej. Brakuje danych dotyczących wpływu diety matki karmiącej na skład HMO. W badaniu obserwacyjnym prowadzonym w Gambii w Afryce stwierdzono znacznie wyższą zawartość HMO w mleku w 20. tygodniu laktacji w porze suchej (n=21) w porównaniu z porą deszczową (n=12) [30].
Rozwój mikrobioty jelitowej niemowląt jest sekwencyjnym procesem, który rozpoczyna się już wewnątrzmacicznie i trwa przez pierwsze 2–3 lata życia. Skład mikrobioty zależny jest od czynników genetycznych, ale również środowiskowych, których głównym elementem jest dieta [3, 4]. W mikrobiocie jelitowej niemowląt karmionych piersią dominują szczepy Bifidobacterium (B. breve, B. adolescentis, B. longum i B. bifidum) (około 73% wszystkich bakterii), podczas gdy Bifidobacterium (około 31%), Bacteroides i Enterobakterie są typowe dla niemowląt karmionych mlekiem modyfikowanym [31, 32]. Badania przeprowadzone w ciągu ostatniej dekady wykazały, że konkretne gatunki Bacteroides i Bifidobacterium, które zwykle kolonizują przewód pokarmowy niemowląt karmionych piersią, wykorzystują HMO w procesach metabolicznych. Dotyczy to szczególnie B. longum ssp. infantis (B. infantis), który jest dominującym mikroorganizmem jelitowym w tej grupie dzieci [7]. Rzeczywiście, w ostatnim badaniu z udziałem niemowląt karmionych mieszanką suplementowaną 2‘-FL (1g/l) i LNnT (0,5g/l) wykazano, że skład mikrobioty niemowląt karmionych mieszankami z dodatkiem 2‘-FL i LNnT był znacząco różny od niemowląt karmionych mieszanką bez dodatku tych oligosacharydów [33].
Przede wszystkim stwierdzono znacznie bogatszą reprezentację Bifidobacterium oraz ubogą – Escherichia i Peptostreptococcaceae. Ponadto stężenia kilku ważnych metabolitów w kale (propionian, maślan i mleczan) u niemowląt karmionych mieszanką suplementowaną HMO były bardziej zbliżone do stężeń stwierdzanych w kale niemowląt karmionych wyłącznie piersią.
HMO stanowią substraty metaboliczne dla specyficznych i potencjalnie prozdrowotnych bakterii w przewodzie pokarmowym [33, 34, 35], co czyni je pierwszymi prebiotykami, które otrzymuje człowiek po urodzeniu, jeżeli jest karmiony piersią.
Bifidobacterium i Lactobacillus spp. obecne w przewodzie pokarmowym noworodków i niemowląt różnią się zdolnością do wykorzystywania i/lub trawienia HMO. Bifidobacterium infantis w porównaniu z Lactobacillus gasseri ma doskonałą zdolność trawienia HMO [36]. Genom B. infantis koduje 24 różne glikozydazy, enzymy odpowiedzialne za odcinanie poszczególnych jednostek monosacharydowych od oligosacharydów, w tym 2 α-sialidazy i 5 α-L-fukozydaz [37]. Ponadto Bifidobacterium bifidum może uwalniać monosacharydy z HMO, ale nie ma możliwości wykorzystania takich monosacharydów jak fukoza, kwas sjalowy i N-acetyloglukozamina [38]. Bifidobacterium breve nie może natomiast „uwalniać” poszczególnych monosacharydów od HMO, ale z kolei ma możliwość ich wykorzystania, jeśli będą obecne w formie wolnej [36, 39].
Ostatnie dane z badań ex vivo sugerują, że działania prebiotyczne różnych HMO różnią się i są specyficzne dla struktury. Skład drobnoustrojów izolowanych z próbek kału niemowląt i hodowanych w warunkach beztlenowych zmienia się w czasie w zależności od tego, jakie HMO są dodawane do mleka. Na przykład skład drobnoustrojów jest inny po ekspozycji na mieszaninę HMO, która została wyizolowana z mleka kobiecego i na pojedyncze HMO, takie jak 2’-FL lub LNT. Ponieważ zróżnicowany skład i aktywność drobnoustrojów są związane ze schorzeniami, takimi jak otyłość, cukrzyca, przewlekłe zapalenie jelit lub autyzm, narażanie niemowląt na działanie pojedynczych HMO w mieszankach zamiast złożonej mieszaniny HMO w mleku kobiecym prawdopodobnie zwiększa prawdopodobieństwo ich wystąpienia w przyszłości [33]. Jednak HMO to coś więcej niż „food for bugs (żywność dla bakterii)”. HMO wykazują bezpośrednie działanie bakteriostatyczne lub bakteriobójcze. Na przykład hamują wzrost Streptococcus agalactiae (Streptococcus grupy B; GBS) wiodącej przyczyny inwazyjnych infekcji bakteryjnych u noworodków, nabywanych podczas porodu na skutek kolonizacji pochwy i kanału szyjki macicy u matki [34]. Zakażenie wiąże się z ryzykiem zapalenia płuc, sepsy i zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Badania z zastosowaniem najnowszych technologii, opartych na technikach chromatograficznych wykazały, że efekt bakteriostatyczny zależy od struktury oligosacharydów, a LNT jest najbardziej skuteczny w tym działaniu. Wzrost GBS był specyficznie hamowany przez LNT i LNFP-I, podczas gdy sjalowana frakcja HMO lub galaktooligosacharydy (GOS) nie wykazywały żadnego efektu. Dane eksperymentalne sugerują udział glikozylotransferazy GBS, która prawdopodobnie wiąże się z wybranymi oligosacharydami. Ponadto HMO wykazują synergiczne działanie do stosowanej antybiotykoterapii wankomycyną i cyprofloksacyną [33].

HMO – działanie antyadhezyjne

Mechanizm antybakteryjnego i antywirusowego działania HMO opiera się na podobieństwie strukturalnym HMO do łańcuchów cukrowych glikokoniugatów, tj. glikoprotein i glikolipidów obecnych na powierzchni komórek nabłonkowych noworodków/niemowląt. Dzięki temu HMO „naśladują” powierzchniowe glikany komórek nabłonkowych. Rozpuszczalne fukozylowane i sjalowane oligosacharydy mleka ludzkiego „przechodzące” przez układ pokarmowy noworodka „opłukują” komórki nabłonka gardła, przełyku i jelit noworodka i mogą być rozpoznawane i związane przez (1) receptory lektynowe fukozo- i/lub sjalo-zależnych bakterii i/lub przez (2) receptory lektynowe obecne na powierzchni komórek nabłonkowych gospodarza. W obu przypadkach fukozylowane i/lub sjalowane HMO, jako „wabiki-inhibitory”, uczestniczą w blokowania receptorów lektynowych. Zablokowane przez HMO receptory lektynowe bakterii nie mogą uczestniczyć w reakcji rozpoznania glikotopów obecnych na powierzchni komórek gospodarza, co nie pozwala na ich adhezję i kolonizację, a utworzone kompleksy bakteria-HMO są usuwane wraz z kałem [13, 16, 17, 40]. Hamujący wpływ HMO w adhezji do tkanek gospodarza wykazano dla fukozo- i/lub sjalo-zależnych patogenów takich jak m.in. Campylobacter jejuni [41], enteropatogennych Escherichia coli [42], Listeria monocytogene, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae, niektórych wirusów (norowirusy), a także pierwotniaków – Entamoeba histolytica [35, 43, 44]. HMO mogą również wywierać bezpośredni wpływ na komórki nabłonkowe, niezależnie od drobnoustrojów, powodując ich większą odporność na zakażenie. Na przykład komórki nabłonka pęcherza moczowego, pod wpływem HMO, są znacznie bardziej odporne na uropatogenną inwazję E. coli [45].
Szczególnie interesujące badania dotyczą martwiczego zapalenia jelit (ang. necrotizing enterocolitis, NEC) u noworodków z bardzo małą urodzeniową masą ciała. Częstość występowania w tej grupie wcześniaków wynosi około 5%, a śmiertelność ponad 25%. Natomiast ryzyko wystąpienia NEC u dzieci karmionych mieszanką jest od 6- do 10-krotnie wyższe [41]. W przeciwieństwie do mieszanki, mleko kobiece jest bogatym źródłem HMO. Ponadto w zapobieganiu NEC wykazano wpływ mleka kobiecego z Banku Mleka. Mleko pochodzące z Banku Mleka przed podaniem noworodkom podlega procedurze pasteryzacji, która ma na celu pozbawienie go potencjalnie patogennych mikroorganizmów z jednoczesnym zachowaniem najwyższej z możliwych aktywności biologicznej. Niezależnie od metod pasteryzacji mleka, które w różnym stopniu niszczą lub częściowo dezaktywują wiele bioaktywnych składników mleka, struktury HMO pozostają nienaruszone [46] i nadal są zdolne do pełnienia funkcji biologicznych. Na podstawie tych obserwacji wysunięto hipotezę, że HMO przyczyniają się do niższej częstości występowania NEC u noworodków karmionych mlekiem kobiecym, w tym mlekiem pochodzącym z Banku Mleka.
Ponadto fukozylowane i sjalowane HMO, dzięki właściwościom obniżania toczenia i adhezji leukocytów do komórek śródbłonka, mogą uczestniczyć w wyciszaniu procesów immunologicznych, takich jak zdolność do fagocytozy i wytwarzania reaktywnych form tlenu, które są istotne w rozwoju martwiczego zapalenia jelit [47, 48, 49].
Spośród wielu sjalowanych oligosacharydów mleka, jeden konkretny HMO, disjalolakto-N-tetroza (DSLNT), która zawiera dwie cząsteczki kwasu sjalowego, odgrywa ważną rolę w zmniejszaniu częstości występowania chorób zapalnych, w tym NEC, u niemowląt karmionych piersią w porównaniu do niemowląt karmionych mlekiem modyfikowanym. DS-LNT, który jest jednym z najliczniejszych disjalowanych oligosacharydów mleka ludzkiego, może być stosowany jako środek przeciwzapalny [15, 50]. Enzymatyczne usunięcie tylko jednego z kwasów sjalowych obecnych w strukturze DSLNT doprowadziło do całkowitej utraty funkcji, co wskazuje, że wykazywany efekt biologiczny jest wysoce specyficzny dla tej struktury.
W wieloośrodkowym prospektywnym badaniu kohortowym zaobserwowano, że niektóre niemowlęta nadal rozwijają NEC, mimo że otrzymują głównie mleko kobiece. Ponieważ skład HMO różni się u poszczególnych kobiet, wysunięto kolejną hipotezę, że niemowlęta, u których rozwija się NEC, otrzymywały mleko z mniejszą ilością DSLNT. Do badania włączono 200 pacjentów, przeanalizowano skład HMO w mleku kobiecym w czasie pierwszych 28 dni po porodzie, stężenia DSLNT były znacznie niższe w mleku matek, których dzieci wykazywały objawy NEC. Na podstawie oznaczenia stężenia DSLNT w mleku matek można zidentyfikować pacjentów zagrożonych NEC jeszcze przed jego wystąpieniem. W świetle powyższych doniesień sugeruje się, że DSLNT w mleku ludzkim może stanowić dodatkowy potencjalny nieinwazyjny marker pozwalającym na identyfikację niemowląt z grupy większego ryzyka rozwoju NEC [42, 51]. Ponadto DSLNT może zostać wykorzystana w niedalekiej przyszłości jako naturalny „wzorzec” do opracowywania nowych środków terapeutycznych stosowanych w leczeniu NEC [51].
Ze względu na podobieństwo strukturalne HMO z glikanami śluzówkowymi oraz ich stabilność w przewodzie pokarmowym, prawdopodobnie wpływają one na liczne procesy, w których pośredniczy cukier, jako element rozpoznania biologicznego opartego na receptorze lektynowym i ligandzie cukrowym, takie jak kolonizacja mikrobioty we wczesnym okresie życia i zakaźność patogenów. W oparciu o obserwacje kliniczne i podstawowe dane z badań, HMO działają w sposób specyficzny, zależny od ich struktury, pozwalając na ukształtowanie prawidłowego mikrobiomu, odporności na patogeny oraz właściwej „reaktywności“ bariery błon śluzowych, przyczyniając się w ten sposób do ochrony immunologicznej.
HMO badano w związku z występowaniem zakaźnej biegunki w kohorcie matek i niemowląt w Meksyku (n=93) [52, 53]. Wyższe stężenia α2-fukozylowanych HMO w mleku matki były związane z mniejszą częstością występowania biegunki, niezależnie od patogenu wywołującego, od umiarkowanej do ciężkiej. Najczęstszą zidentyfikowaną przyczyną biegunki w kohorcie był Campylobacter jejuni, a następnie kaliciwirus i enteropatogenna Escherichia coli. W szczególności wyższe stężenia 2’-FL i LNFP-I w mleku matki były skorelowane z niższą częstością występowania odpowiednio biegunki wywołanej przez C. jejuni i kaliciwirusa. Te obserwacje w okresie karmienia piersią nie utrzymały się w okresie po karmieniu piersią, co wskazuje na możliwy „przejściowy“ efekt HMO w ochronie przed zakaźną biegunką. 
W pilotażowym badaniu 49 par matka-niemowlę zbadano zależność między spożyciem oligosacharydów z mleka ludzkiego, zawartością oligosacharydów w kale, a późniejszą chorobowością niemowląt karmionych piersią. Wyższe stężenia pentasacharydu LNF-II w mleku matki po 2 tygodniach były związane z niższym ryzykiem chorób układu oddechowego i pokarmowego u niemowląt w wieku 6 i 12 tygodni [54]. Związek ten nie był już znaczący po okresie zakończenia karmienia piersią. Podobnie w kohortowym badaniu 143 dzieci HIV pozytywnych z Zambii wyższe stężenie fukozylowanych HMO w mleku matki miesiąc po porodzie wiązało się z niższym ryzykiem zgonu do 2. r.ż. [55]. W badaniu matek i niemowląt z Gambii (n=33) wyższe względne stężenia fukozylowanych HMO w mleku matki (LNFP-I i LNFP-III) oraz towarzyszące im niższe stężenie LNT wiązały się z niższym ryzykiem zachorowania do 4. m.ż. [30].
W przypadku patogenów układu oddechowego bezpośrednia ekspozycja na HMO wydaje się mniej oczywista, a zatem w domniemanej ochronie związanej z HMO może pośredniczyć mikrobiom jelitowy. Jednak eksperymentalnie wykazano, że bezpośrednia ekspozycja Streptococcus pneumoniae na LNnT i sjalo-LNnT skutecznie blokowała kolonizację przez ten patogen płuc w modelu króliczym [56]. Wykazano, że 3’-SL i 2’-FL mogą in vitro zmniejszać częstość infekcji wirusowych wywołanych przez syncytialnego wirusa oddechowego (RSV) poprzez znaczące zmniejszenie obciążenia wirusowego RSV i stężenia cytokin w nabłonku dróg oddechowych [57].
Podobny efekt zaobserwowano również dla 6’-SL i LNnT przy obciążeniu wirusem grypy [57].
Od 4 do 14% HMO może być absorbowane w jelicie cienkim noworodka i pozostawać w jego krwiobiegu nawet przez kilka godzin. Stężenie głównego oligosacharydu, 2’-fukozylolaktozy we krwi noworodków osiąga poziom 1,5 mg/l. HMO są następnie usuwane z organizmu wraz z moczem, w którym stężenie 2’-fukozylolaktozy wzrasta do 100 mg/l [13, 47, 58]. Dodatkowo, Goehring i współpracownicy [59] zaobserwowali znacznie wyższe stężenie 6’-SL (26,1±17,2 mg/l) w moczu niemowląt karmionych piersią w porównaniu do niemowląt karmionych mlekiem modyfikowanym (0,9±0,3 mg/l). Obecne w moczu oligosacharydy mogą, podobnie jak to ma miejsce w przewodzie pokarmowym, zapobiegać adhezji patogenów do komórek nabłonkowych układu moczowego i w ten sposób aktywnie uczestniczyć w ochronie niemowląt przed infekcjami układu moczowego [13, 47, 58].HMO mogą także modulow ać funkcjonowanie niedojrzałego układu odpornościowego noworodka na poziomie komórkowym. W osoczu niemowląt karmionych mlekiem kobiecym, HMO wykrywa się w stężeniach 1–133 mg/l [59, 60]. Sugeruje się, że HMO może bezpośrednio wpływać na komórki odpornościowe krążące we krwi. 

Oligosacharydy mleka ludzkiego jako immunomodulatory

Podczas procesów zapalnych, selektyny E i P obecne na powierzchni komórek śródbłonka rozpoznają i uczestniczą w oddziaływaniach z glikotopami sjalo-Lewis X (sLeX), częścią glikokoniugatów na powierzchni leukocytów, które są jednym z elementów uczestniczących w procesie wynaczynienia leukocytów i naciekania błony śluzowej [47, 50]. Podobnie niektóre oligosacharydy mleka ludzkiego mogą być rozpoznawane przez receptory układu odpornościowego i w ten sposób mogą uczestniczyć w modulacji adhezji komórek u niemowląt karmionych piersią [14, 50]. Pierwsze dane eksperymentalne sugerujące, że HMO „zakłócają“ proces toczenie się leukocytów i potencjalnie zmniejszają ich wynaczynienie, zostały zaprezentowane przez Rudloffa i współpracowników [61].
W oparciu o wcześniejsze eksperymenty [61], Bode i Jantscher-Krenn [14] spekulują, że 3’-sjalo-3-fukozylolaktoza (3’-S,3-FL) obecna w mleku ludzkim oraz bardziej złożone strukturalnie cząsteczki HMO, które w swojej strukturze zawierają więcej niż jeden glikotop sjalo-Lewis X, który umożliwia wielowartościowe wiązanie z selektynami, może uczestniczyć w hamowaniu toczenia, a następnie adhezji leukocytów. Ponadto, w porównaniu do glikotopu sjalo-Lewis X i 3’-S,3-FL, pula wszystkich sjalowanych HMO była w tym zakresie bardziej skuteczna. Natomiast zastosowanie najprostszych sjalowanych HMO, takich jak trisacharydy 3’-SL i 6’-SL, nie miało żadnego wpływu na proces toczenia i adhezję leukocytów [14, 61].
Ponieważ HMO są strukturalnie podobne do ligandów selektyny [62], prawdopodobne jest, że HMO mogą „wiązać się“ bezpośrednio z komórkami układu odpornościowego i modulować reakcje immunologiczne. HMO bezpośrednio wpływa na proliferację komórek odpornościowych i produkcję cytokin w eksperymentach ex vivo z komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC). HMO indukowały także produkcję cytokin IL-10 oraz IFN-γ [63, 64]. 
Oprócz HMO, które mogą w swojej strukturze zawierać glikotopy typu Lewis lub sjalo-Lewis i stanowić ligandy dla selektyn, przekazywanie informacji przez komórki układu odpornościowego może odbywać się także poprzez inne receptory lektynowe, np. typu S – galektyny oraz typu I – siglektyny. Receptory te rozpoznają określone struktury cukrowe glikokoniugatów (glikoprotein i glikolipidów), które są także obecne w strukturach HMO, 
np. N-acetylo-laktozamina (LacNAc) i sjalowana N-acetylo-laktozamina (sjalo-LacNAc) [65].
Wyniki ostatnich badań świadczące o znaczeniu mikrobioty jelitowej dla zdrowia i występowania takich chorób jak alergia, podkreślają znaczenie tzw. okna możliwości we wczesnym okresie życia, podczas którego interwencje zmieniające mikrobiotę jelitową wywołują długofalowe skutki. Skład i metabolizm mikrobioty jelitowej noworodka mogą odgrywać istotną rolę w ryzyku chorób alergicznych. Karmienie piersią kształtuje mikrobiotę jelitową we wczesnym okresie życia, zarówno bezpośrednio przez „narażenie” noworodka na mikrobiotę obecną w mleku matki, jak i pośrednio, poprzez czynniki mleka matki, takie jak HMO, które wpływają na wzrost bakterii i ich metabolizm. Potencjał mleka do modulowania wczesnej mikrobioty jelitowej potomstwa jest obiecującym narzędziem w zapobiegania alergii [66]. W ostatnich badaniach wykazano, że niskie stężenia LNFP III (<60 μM) w mleku kobiecym było czynnikiem ryzyka rozwoju alergii na białka mleka krowiego [67].
Ponadto, obecne w krwiobiegu niemowlęcia HMO są istotne dla prawidłowego rozwoju mózgu. Fukozylowane i sjalowane HMO stanowią dodatkowe źródło fukozy i kwasu sjalowego do syntezy nowych glikokoniugatów, które odgrywają istotną rolę w prawidłowym rozwoju i funkcjonowaniu ośrodkowego układu nerwowego, m.in. w przekazywaniu impulsów między neuronami [13, 47]. Ruhaak i współpracownicy [60] spekulują, że niewielkie ilości kwasów sjalowych związanych z HMO oraz wolne kwasy sjalowe obecne w świetle jelita cienkiego lub okrężnicy niemowląt karmionych mlekiem matki mogą zostać wchłonięte do krwioobiegu niemowląt, a następnie przekroczyć barierę krew-mózg, docierając do niedojrzałego mózgu. Z kolei, badania na modelu zwierzęcym wykazały, że suplementacja 2’-fukozylolaktozą istotnie wzmacnia procesy poznawcze oraz pamięć u suplementowanych zwierząt [13, 47].
 

Tabela opracowana na podstawie [74]

HMO a rozwój tolerancji immunologicznej

Najnowsze badania Xiao i współpracowników z 2019 roku [68] wykazały, że HMO wyizolowane z mleka ludzkiego, indukują semi-dojrzewanie komórek dendrytycznych (DC), które odgrywają kluczową rolę w regulacji odpowiedzi odpornościowej, m.in. specjalizując się w prezentacji antygenu oraz różnicowaniu komórek T. Ponadto, HMO powodują podniesienie stężeń IL-10, IL-27 i IL-6, ale nie wykazują wpływu na stężenia IL-12p70 i TNF-α.
Konsekwentnie, pod wpływem HMO ludzkie moDC promowały wytwarzanie limfocytów regulatorowych (Treg) z komórek T CD4 +. Wydaje się, że regulacyjna rola HMO opiera się na oddziaływaniach HMO z receptorami na ludzkich moDC, w tym między innymi na oddziaływaniach z receptorem TLR4 i DC-SIGN. Podsumowując, HMO zawierają czynniki tolerogenne wpływające na ludzkie moDC i tym samym modulują rozwój układu odpornościowego noworodków. 
Postęp w biotechnologii farmaceutycznej i przemysłowej pozwolił na zsyntetyzowanie kilku HMO, a mianowicie 2’-FL i LNnT. Przedkliniczne testy toksyczności wykazały ich bezpieczeństwo i oba uzyskały zatwierdzenie w krajach Unii Europejskiej oraz uznano je za bezpieczne także w USA.
W celu zbadania wpływu mieszanek mlecznych suplementowanych o wybrany HMO, tj. 2’-fukozylolaktozę na biomarkery funkcji odpornościowej u zdrowych niemowląt urodzonych w terminie przeprowadzono randomizowane, podwójnie zaślepione, badania wzrostu i tolerancji u zdrowych noworodków z masą urodzeniową ≥2490 g, które były karmione wyłącznie mlekiem modyfikowanym (n=317) lub wyłącznie piersią (n=107) do 4. m.ż.
Niemowlęta karmione mlekiem modyfikowanym dla niemowląt z dodatkiem 2’-FL w stężeniu 0,2 lub 1 g/l w połączeniu z GOS lub mlekiem modyfikowanym tylko z samym GOS wykazywały podobne przyrosty masy ciała jak niemowlęta karmione piersią do 4. m.ż. Markery odpornościowe mierzono w poszczególnych grupach niemowląt w osoczu na początku i po stymulacji komórek krwi RSV. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) noworodków w poszczególnych grupach izolowano do fenotypowania komórkowego i stymulowano ex vivo fitohemagglutyniną lub syncytialnym wirusem oddechowym (RSV). Stężenia cytokin zmierzono w osoczu noworodków i w supernatantach hodowli stymulowanych ex vivo. Globalnie profil odpornościowy był podobny do profilu niemowląt karmionych piersią, gdy mieszanka dla niemowląt została uzupełniona 2’-FL [69]. W kolejnym randomizowanym badaniu wykazano, że początkowa mieszanka dla niemowląt uzupełniona o dwa HMO, 2‘-FL (1,0 g/l) i LNnT (0,5 g/l) (n = 88) pozwoliła na prawidłowe wzrastanie noworodków urodzonych o czasie i była dobrze tolerowana w porównaniu z tą samą mieszanką dla niemowląt bez HMO (n=87). Interesujący jest fakt, że wykazano związek między karmieniem mieszanką z dwoma HMO a mniejszą częstością schorzeń dolnych dróg oddechowych i stosowaniem leków (zwłaszcza antybiotyków i środków przeciwgorączkowych) w 1. r.ż. i po 6-miesięcznym okresie karmienia. Po 3 miesiącach profil mikrobioty u niemowląt karmionych mieszanką z dwoma HMO, tj. 2‘-FL i LNnT był podobny do niemowląt karmionych piersią. Ta zmiana była spowodowana głównie wzrostem liczby bakterii Bifidobacterium, z jednoczesnym zmniejszeniem liczby Escherichia i Peptostreptococcaceae [70, 71].
W świetle najnowszych doniesień noworodki mają kontakt z wolnymi oligosacharydami już w trakcie życia płodowego. W ubiegłym roku Wise i wsp. [72] opublikowali pierwsze badania wskazujące, że wolne oligosacharydy są obecne także w płynie owodniowym, ale w stężeniu mniejszym niż w mleku matki. Wykazano obecność 2‘-fukozylolaktozy, 3-fukozylolaktozy, difukozylolaktozy oraz 6‘-sjalolaktozy, których względna zawartość była różna w mleku matki i płynie owodniowym. Płód jest więc już „narażony“ na kontakt z HMO w macicy, co uzasadnia przyszłe badania w celu zbadania bezpośrednich i długoterminowych konsekwencji tego faktu dla zdrowia i rozwoju płodu i niemowląt. Badania pilotażowe wykazały ponadto, że HMO są także obecne w surowicy matki, co sugeruje ich znaczenie już w czasie ciąży. Stężenie i skład HMO w surowicy matki podczas ciąży różniły się w zależności od wieku ciążowego i statusu „wydzielacza”. Stężenie HMO wzrastało wraz z wiekiem ciążowym i zmieniało się z profilu głównie sjalowanego 
w 10.–14. tygodniu ciąży na bardziej zrównoważony stosunek fukozylowany do sjalowanych HMO w 30.–35. tygodniu ciąży, głównie z powodu znacznego wzrostu 2’-fukozylolaktozy. Sugeruje się, że skład ciała matki jest powiązany z „prenatalnymi” HMO oraz wskazuje, że metabolizm matki moduluje skład HMO z nieznanymi implikacjami dla zdrowia matki i płodu już w czasie ciąży [73]. 
Wolne oligosacharydy są także obecne w mleku krowim, niemniej jednak zarówno skład jakościowy, jak i ilościowy jest odmienny od profilu oligosacharydów mleka ludzkiego. Najważniejsze różnice przedstawiono w tabeli 1.HMO mleka kobiecego i mleka krowiego (BMO, ang. bovine milk oligosacharides) z powodu różnic stężenia i budowy wykazują różne poziomy ochrony przeciwko ludzkim patogenom. Największe różnice są obserwowane dla fukozylowanych oligosacharydów [74].

Podsumowanie

Na skład HMO największy wpływ ma status „wydzielacza”/„niewydzielacza” matki, determinowany przez geny FUT2 i FUT3. Jest to prawdopodobnie spowodowane ewolucyjną presją selekcyjną wywieraną przez patogeny na organizm człowieka. Zmienność składu HMO na kolejnych etapach laktacji prawdopodobnie wskazuje na różne potrzeby niemowląt zależneod etapu ich rozwoju. Bogata różnorodność HMO może modulować zarówno wrodzoną, jak i nabytą odporność noworodków. Wyniki eksperymentów in vitro i na modelach zwierzęcych wskazują, że HMO oddziałuje bezpośrednio z komórkami nabłonka przewodu pokarmowego, a także moduluje dojrzewanie i funkcjonowanie niedojrzałego układu odpornościowego noworodków. HMO korzystnie wpływa również na mikrobiom niemowlęcia karmionego piersią. Zwiększona dostępność niektórych HMO ze źródeł komercyjnych, jak również gromadzenie dowodów wskazujących, że preparat suplementowany HMO jest bezpieczny i może być korzystny, umożliwił dodanie 2‘-FL lub 2‘-FL w połączeniu z LNnT do preparatów dla niemowląt. Ponadto, ze względu na ich korzystny wpływ na układ odpornościowy, HMO mogą być również korzystne dla innych niż noworodki i niemowlęta populacyjnych grup wiekowych, które wykazują upośledzoną odporność lub wysokie ryzyko infekcji. Obserwacje kliniczne potwierdzone danymi przedklinicznymi i interwencyjne badania kliniczne potwierdzają kluczową rolę HMO w ochronie odpornościowej, przede wszystkim chronią przed schorzeniami infekcyjnymi, a zatem pośrednio zmniejszają zapotrzebowanie na antybiotykoterapię, najprawdopodobniej poprzez modulację mikrobioty jelitowej we wczesnym okresie życia. Dalsze badania kliniczne są uzasadnione w celu poszerzenia wiedzy dotyczącej biologii HMO i ich znaczenia dla żywienia niemowląt.
Niemniej jednak podczas karmienia piersią mleko matki dostarcza noworodkom i niemowlętom składniki biologicznie aktywne niezbędne do prawidłowego wzrostu i rozwoju, a także składniki immunomodulujące, w tym HMO, które wspierają ich niedojrzały układ odpornościowy. W tym ujęciu wolne oligosacharydy mleka ludzkiego są klasyfikowane jako element odporności wrodzonej, przekazywanej potomstwu wraz z mlekiem matki. 

Piśmiennictwo

1. American Academy of Pediatrics, Section on Breastfeeding: Breastfeeding and the use of human milk. Pediatrics 2012,129:e827–e841.
2. Horta B.L., Victora C.G. Long-term Effects of Breastfeeding. Geneva, World Health Organization, 2013. //apps.who.int/ iris/bitst ream/10665/79198/1/9789241505307_eng.pdf.
3. Li M., Wang M., Donovan S.M. Early development of the gut microbiome and immune-mediated childhood disorders. Semin Reprod Med 2014,32:74–869. 
4. Wang M., Monaco M.H., Donovan S.M. Impact of early gut microbiota on immune and metabolic development and function. Semin Fetal Neonat Med 2016,21(6):380–387.
5. Walker W.A., Iyengar R.S. Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis. Pediatr Res 2015,77:220–228.
6. Andreas N.J., Kampmann B., Mehring Le Doare K. Human breast milk: a review on its composition and bioactivity. Early Hum Dev 2015,91:629–635.
7. Donovan S.M., Comstock S.S. Oligosaccharides Influence Neonatal Mucosal and Systemic Immunity. Annales Nestlé 2016,74(3):42–51.
8. Smilowitz J.T., Lebrilla C.B., Mills D.A., German J.B., Freeman S.L. Breast milk oligosaccharides: structure-function relationships in the neonate. Annu Rev Nutr 2014,34:143–169.
9. Kunz C., Meyer C., Collado M.C., et al. Influence of gestational age, secretor and Lewis blood group status on the oligosaccharide content of human milk. J Pediatr Gastroen-terol Nutr 2017,64(5):789–798.
10. Thurl S., Munzert M., Henker J., et al. Variation of human milk oligosaccharides in relation to milk groups and lactational periods. Br J Nutr 2010,104:261–1271.
11. Martín-Sosa S., Martín M.J., García-Pardo L.A., Hueso P. Sialyloligosaccharides in hu-man and bovine milk and in infant formulas: variations with the progression of lactation. J Dairy Sci 2003,86: 52–59.
12. Kunz C., Rudloff S., Baier W., Klein N., Strobel S. Oligosaccharides in human milk: structural, functional, and metabolic aspects. Annu Rev Nutr 2000;20:699–722.
13. Bode L. Human milk oligosaccharides: every baby needs a sugar mama. Glycobiology 2012;22:1147–1162.
14. Bode L., Jantscher-Krenn E. Structure-function relationships of human milk oligosaccharides. Adv Nutr 2012;3:383S–3891S.
15. Autran C.A., Schoterman M.H., Jantscher-Krenn E., et al. Sialylated galacto-oligosaccharides and 2’-fucosyllactose reduce necrotising enterocolitis in neonatal rats. Br J Nutr 2016;116:294–299.
16. Lis-Kuberka J., Orczyk-Pawiłowicz M. [The significance of fucosylated glycoconjugates of human milk in nutrition of newborns and infants]. Postepy Hig Med Dosw (Online). 2015;69:811–29.
17. Lis-Kuberka J., Orczyk-Pawiłowicz M. Sialylated Oligosaccharides and Glycoconjugates of Human Milk. The Impact on Infant and Newborn Protection, Development and Well-Being. Nutrients. 2019;11(2). pii: E306.
18. Smilowitz J.T., O’Sullivan A., Barile D., German J.B., Lönnerdal B., Slupsky C.M. The human milk metabolome reveals diverse oligosaccharide profiles. J Nutr 2013;143:1709–1718.
19. Thurl S., Munzert M., Boehm G., Matthews C., Stahl B. Systematic review of the concentrations of oligosaccharides in human milk. Nutr Rev 2017;75:920–933. 
20. Morrow A.L., Chen C., Cline A., Newburg D.S. Human milk oligosaccharides in preterm and term milk. FASEB J 2016;673.10.
21. Ninonuevo M.R., Perkins P.D., Francis J., et al. Daily variations in oligosaccharides of human milk determined by microfluidic chips and mass spectrometry. J Agric Food Chem 2008;56:618–626.
22. Kumazaki T., Yoshida A. Biochemical evidence that secretor gene, Se, is a structural gene encoding a specific fucosyltransferase. Proc Natl Acad Sci USA 1984;81:4193–4197.
23. Stahl B., Thurl S., Henker J., et al. Detection of four human milk groups with respect to Lewis-blood-group-dependent oligosaccharides by serologic and chromatographic analysis. Adv Exp Med Biol 2001;501:299–306.
24. Totten S.M., Zivkovic A.M., Wu S., et al. Comprehensive profiles of human milk oligosaccharides yield highly sensitive and specific markers for determining secretor status in lactating mothers. J Proteome Res. 2012;11:6124–6133.
25. Lewis Z.T., Totten S.M., Smilowitz J.T., et al. Maternal fucosyltransferase 2 status affects the gut bifidobacterial communities of breastfed infants. Microbiome 2015,3:13. doi: 10.1186/s40168-015-0071-z.
26. Newburg D.S., Ruiz-Palacios G.M., Altaye M., et al. Innate protection conferred by fucosylated oligosaccharides of human milk against diarrhea in breastfed infants. Glycobiology 2004,14: 253–263.
27. Austin S., et al. Temporal Change of the Content of 10 Oligosaccharides in the Milk of Chinese Urban Mothers. Nutrients 2016,8(346):1–22. 
28. De Leoz M.L., et al. Lacto-N-tetraose, fucosylation, and secretor status are highly variable in human milk oligosaccharides from women delivering preterm. J Proteome Res 2012,11(9):4662–72. 
29. McGuire M.K., Meehan C.L., McGuire M.A., et al. What’s normal? Oligosaccharide concentrations and profiles in milk produced by healthy women vary geographically. Am J Clin Nutr 2017;105:1086–1100. 
30. Davis, J.C., et al. Growth and Morbidity of Gambian Infants are Influenced by Maternal Milk Oligosaccharides and Infant Gut Microbiota. Sci Rep 2017,7:40466.
31. Bezirtzoglou E., Tsiotsias A., Welling G.W. Microbiota profile in feces of breast- and formula-fed newborns by using fluorescence in situ hybridization (FISH). Anaerobe 2011;17:478–482.
32. Savino F., Quartieri A., De Marco A., et al. Comparison of formula-fed infants with and without colic revealed significant differences in total bacteria, Enterobacteriaceae and faecal ammonia. Acta Paediatr. 2017;106:573–578. 
33. Bode L. Human Milk Oligosaccharides: Next Generation Functions and Questions. Nestlé Nutrition Institute Workshop Series, 2019,90:191–20.
34. Lin A.E., Autran C.A., Szyszka A., et al. Human milk oligosaccharides inhibit growth of group B Streptococcus. J Biol Chem. 2017,292(27):11243–11249. 
35. Ruiz-Palacios G.M., Cervantes L.E., Ramos P., Chavez-Munguia B., Newburg D.S. Campylobacter jejuni binds intestinal H (O) antigen (Fucα1,2Galβ1,4GlcNAc), and fucosyloligosaccharides of human milk inhibit its binding and infection. J Biol Chem. 2003,278:14112–14120.
36. Ward RE, Niñonuevo M, Mills DA, Lebrilla CB, German JB. In vitro fermentability of human milk oligosaccharides by several strains of bifidobacteria. Mol Nutr Food Res. 2007;51:1398–1405.
37. Underwood MA, German JB, Lebrilla CB, Mills DA. Bifidobacterium longum subspecies infantis: champion colonizer of the infant gut. Pediatr Res. 2015;77:229–235. 
38. Sela D.A., Li Y., Lerno L., Wu S., Marcobal A.M., German J.B., Chen X., et al. An infant-associated bacterial commensal utilizes breast milk sialyloligosaccharides. J Biol Chem 2011;286:11909–11918.
39. Schwab C., Gänzle M. Lactic acid bacteria fermentation of human milk oligosaccharide components, human milk oligosaccharides and galactooligosaccharides. FEMS Microbiol Lett. 2011;315:141–148.
40. Newburg D.S., Grave G. Recent advances in human milk glycobiology. Pediatr Res. 2014;75:675–679. 
41. Neu J., Walker W.A. Necrotizing enterocolitis. N Engl J Med. 2011,364(3):255–264. 
42. Tanner S.M., Berryhill T.F., Ellenburg J.L., et al. Pathogenesis of necrotizing enterocolitis: modeling the innate immune response. Am J Pathol. 2015,185(1):4–16.
43. Manthey C.F., Autran C.A., Eckmann L., Bode L. Human Milk Oligosaccharides protect against enteropathogenic E. coli attachment in vitro and colonization in suckling mice. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2014,58(2):167–70. 
44. Jantscher-Krenn E., Lauwaet T., Bliss L.A., et al. Human Milk Oligosaccharides reduce Entamoeba histolytica attachment and cytotoxicity in vitro. Br J Nutr. 2012,108(10):1839–46.
45. Lin A.E., Autran C.A., Espanola S.D., et al. Human Milk Oligosaccharides Protect Bladder Epithelial Cells Against Uropathogenic Escherichia coli Invasion and Cytotoxicity. J Infect Dis. 2014,209(3):389–98.
46. Hahn W.H., Kim J., Song S., Park S., Kang N.M. The human milk oligosaccharides are not affected by pasteurization and freeze-drying. J. Matern. Fetal Neonatal Med. 2019;32(6):985–991. 
47. Bode L. Human milk oligosaccharides at the interface of maternal-infant health. Breastfeed Med. 2018;13:S7–S8.
48. Bode L., Rudloff S., Kunz C., Strobel S., Klein N. Human milk oligosaccharides reduce platelet-neutrophil complex formation leading to a decrease in neutrophil β2 integrin expression. J. Leukoc. Biol. 2004;76:820–826.
49. Patel A.L., Kim J.H. Human milk and necrotizing enterocolitis. Semin. Pediatr. Surg. 2018;27:34–38. 
50. Jantscher-Krenn E., Zherebtsov M., Nissan C., et al. The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats. Gut 2012;61:1417–1425. 
51. Autran C.A., Kellman B.P., Kim J.H., et al. Human milk oligosaccharide composition predicts risk of necrotizing enterocolitis in preterm infants. Gut 2018 Jun;67(6):1064–1070.  
52. Morrow A.L., et al. Human milk oligosaccharide blood group epitopes and innate immune protection against campylobacter and calicivirus diarrhea in breastfed infants. Adv. Exp. Med. Biol 2004,554:443–446. 
53. Newburg D.S., et al. Innate protection conferred by fucosylated oligosaccharides of human milk against diarrhea in breastfed infants. Glycobiology, 2004,14(3):253–263.
54. Stepans M.B., et al. Early consumption of human milk oligosaccharides is inversely related to subsequent risk of respiratory and enteric disease in infants. Breastfeed Med 2006,1(4):207–15.
55. Kuhn L., et al., Oligosaccharide composition of breast milk influences survival of uninfected children born to HIV-infected mothers in Lusaka, Zambia. J Nutr 2015,145(1):66–72.
56. Idanpaan-Heikkila I., et al. Oligosaccharides interfere with the establishment and progression of experimental pneumococcal pneumonia. J. Infect. Dis 1997,176(3):704–712.
57. Duska-McEwen G., et al. Human Milk Oligosaccharides Enhance Innate Immunity to Respiratory Syncytial Virus and Influenza in Vitro. Food Nutr Sci 2014,5(14):1387–1398.
58. Triantis V., Bode L., van Neerven R.J.J. Immunological Effects of Human Milk Oligosaccharides. Front Pediatr. 2018;6:190. 
59. Goehring K.C., Kennedy A.D., Prieto P.A., Buck R.H. Direct evidence for the presence of human milk oligosaccharides in the circula-tion of breastfed infants. PLoS One 2014,9: e101692. 
60. Ruhaak L.R., Stroble C., Underwood M.A., Lebrilla C.B. Detection of milk oligosaccharides in plasma of infants. Anal Bioanal Chem 2014; 406: 5775–5784.
61. Rudloff S., Stefan C., Pohlentz G., Kunz C. Detection of ligands for selectins in the oligosaccharide fraction of human milk. Eur. J. Nutr. 2002;41:85–92.
62. Newburg D.S., He Y. Neonatal gut microbiota and human milk glycans cooperate to attenuate infection and inflammation. Clin Obstet Gynecol 2015; 58: 814–826.
63. Comstock S.S., Wang M., Hester S.N., et al.: Select human milk oligosac- charides directly modulate peripheral blood mononuclear cells isolated from 10-d-old pigs. Br J Nutr 2014,111:819–828.
64. Koning N., Kessen S.F., Van Der Voorn J.P., et al. Human milk blocks DCSIGN-pathogen interaction via MUC1. Front Immunol 2015,6:112. 
65. Kolarich D., Lepenies B., Seeberger P.H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Curr Opin Chem Biol. 2012;16(1–2):214–20.
66. van den Elsen L.W.J., Garssen J., Burcelin R., Verhasselt V. Shaping the Gut Microbiota by Breastfeeding: The Gateway to Allergy Prevention? Front Pediatr. 2019;7:47.
67. Seppo A.E., Autran C.A., Bode L., Järvinen K.M. Human milk oligosaccharides and development of cow’s milk allergy in infants. J Allergy Clin Immunol 2017,139(2):708–711.
68. Xiao L., van De Worp W.R., Stassen R., et al. Human milk oligosaccharides promote immune tolerance via direct interactions with human dendritic cells. Eur J Immunol. 2019; 49(7):1001–1014. 
69. Goehring K.C., Marriage B.J., Oliver J.S., et al., Similar to Those Who Are Breastfed, Infants Fed a Formula Containing 2’-Fucosyllactose Have Lower Inflammatory Cytokines in a Randomized Controlled Trial. J Nutr 2016,146(12):2559–2566. 
70. Alliet P., et al. Term Infant Formula Supplemented with Human Milk Oligosaccharides (2’Fucosyllactose and Lacto-N-neotetraose) Shifts Stool Microbiota and Metabolic Signatures Closer to that of Breastfed Infants. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2016,63(1):S55.
71. Sprenger N. Human Milk Oligosaccharides (HMO): Factors Affecting their Composition and their Physiological Significance. Nestlé Nutrition Institute Workshop Series, 2019,90:43–56.
72. Wise A., Robertson B., Choudhury B., et al. Infants Are Exposed to Human Milk Oligosaccharides Already in utero. Front Pediatr. 2018;6:270.
73.  Jantscher-Krenn E., Aigner J., Reiter B., et al. Evidence of human milk oligosaccharides in maternal circulation already during pregnancy: a pilot study.  Am J Physiol Endocrinol Metab. 2019;316(3):E347–E357. 
74. Peterson R., Cheah W.Y., Grinyer J., Packer N. Glycoconjugates in human milk: protecting infants from disease. Glycobiology. 2013;23(12):1425–38.